Communications Flash

Communication Flash 1

Inhibition of 3CLpro enzymes of four coronaviruses :

from High Throughput Screening to positive confirmation

Paul Carré¹, Valerie Landry^1-2, Hugo Hennequin¹, Xavier Hanoulle³, Julie Charton¹, Benoit Deprez^1-2, Florence Leroux^1-2

¹U1177 - Drugs and Molecules for Living Systems. Institut Pasteur de Lille, Université de Lille, Inserm, F-59000 Lille, France

²UAR2014-US41-ARIADNE Criblage. Plateformes Lilloises en Biologie et Santé, 59000 Lille, France

³EMR9002 – Biologie Structurale Intégrative. CNRS, F-59000, Lille, France

Le virus SARS-CoV-2 est responsable de la pandémie de COVID-19 et d’infections potentiellement mortelles qui continuent d’affecter des millions de personnes dans le monde. La protéase 3CLpro est une protéase à cystéine impliquée dans le clivage des polyprotéines virales constituant une étape cruciale de la réplication virale. Cette protéase est conservée parmi les autres coronavirus comme le SARS-CoV-1 ; MERS-CoV et HCoV-229E. Elle constitue ainsi une cible thérapeutique pertinente pour le développement d’antiviraux à large spectre et de lutte contre l’émergence de futurs coronavirus.

Nous avons optimisé puis réalisé un criblage à haut-débit de 146 composés sur les 4 enzymes 3CLpro des coronavirus SARS-CoV-2 ; SARS-CoV-1 ; MERS-CoV et HCoV-229E en dose-réponse. Nous avons obtenu 108 composés sur le criblage 3CLpro SARS-CoV-2 pour lesquels nous avons déterminé une valeur de pIC50 correspondant à plus de 70% d’inhibition de l’activité enzymatique. 98 produits sur 3CLpro SARS-CoV-1 ont des pIC50 comparables avec les résultats sur 3CLpro SARS-CoV-2. Nous avons ensuite confirmé 17 composés sur 3CLpro MERS-CoV en utilisant deux protocoles. Enfin, nous avons identifié 15 composés avec des pIC50 sur 3CLpro HCoV-229E.

Pour conclure, ce sont 15 analogues qui ont été identifiés comme composés pan-inhibiteurs, avec un composé (Δ262) comme étant l’analogue le plus actif sur les 4 enzymes virales.

Communication Flash 2

High-throughput screening for discovering bioactive compounds that modulates antigen presentation

Laetitia Lesire¹, Adrien Herledan^1-2, Florence Leroux^1-2, Cyril Couturier^1-2, Benoit Deprez^1-2,Rebecca Deprez-Poulain¹

¹Univ. Lille, Inserm, Institut Pasteur de Lille, U1177- EGID - Drugs and Molecules for Living Systems, F-59000 Lille, France

²UAR2014-US41-ARIADNE Criblage. Plateformes Lilloises en Biologie et Santé, 59000 Lille, France

La présentation antigénique est un processus par lequel une cellule de l’organisme présente des peptides antigéniques via son CMH de classe 1 aux lymphocytes T cytotoxiques. Ce phénomène permet la reconnaissance et l’élimination des cellules anormales. Cependant, un dérèglement du système immunitaire causé par un défaut de présentation antigénique peut être responsable du développement de maladies auto-immunes et de cancer. Trouver des modulateurs de la présentation antigénique constitue alors une opportunité thérapeutique pour le traitement de ces maladies. Le laboratoire INSERM U1177 développe des inhibiteurs des enzymes ERAPs impliquées dans le clivage des peptides antigéniques dans le réticulum endoplasmique pour la présentation sur le CMH de classe 1. Nous avons développé un essai de présentation antigénique basé sur la transfection transitoire de cellules HEK-293 par un plasmide codant pour 1/ un précurseur de peptide antigénique L-SIINFEKL, qui pourra être pris en charge par les ERAPs pour produire le peptide antigénique SIINFEKL, 2/ le CMH de classe 1 de souris H2KB présentant un tag HiBit de la nanoluciférase ainsi 3/ qu’un inhibiteur du transporteur des peptides antigéniques endogènes TAP. Nous avons criblé 2806 composés dans un essai homogène permettant la mesure de la présentation antigénique par complémentation de la nanoluciférase en luminescence ainsi que la mesure de la viabilité cellulaire par la quantification de l’ATP dans les cellules. Nous avons ensuite confirmé la sélectivité des composés dans un essai orthogonal en immunofluorescence par l’utilisation d’un anticorps dirigé contre le complexe H2KB/SIINFEKL. Enfin, les composés confirmés ont été testés dans un essai secondaire de co-culture avec des lymphocytes T cytotoxiques, activés par cette présentation antigénique. L’ensemble de ces essais a permis l’identification de deux composés dont un médicament qui n’est pas décrit dans la littérature pour cette activité. Enfin, une famille chimique d’inhibiteurs de la nanoluciférase a été identifié comme interférent à la technologie de luminescence du test.

Communication Flash 3

La régulation allostérique par les domaines trans-membranaires de BCL-xL et PUMA limite l’antagonisme par des molécules BH3 mimétiques

Laurent Maillet¹, Aurélie Fétiveau¹, Stéphane Téletchéa², Philippe Juin¹

1. Nantes Université, INSERM, CNRS, CRCI²NA, U1307, UMR6075, F-44000 Nantes, France.
2. Nantes Université, CNRS, US2B, UMR 6286, F-44000 Nantes, France

Dans les cellules cancéreuses, l'échappement à l'apoptose par des protéines anti-apoptotiques de la famille BCL-2 est un événement récurrent en réponse aux stress inhérents à la progression tumorale et à la plupart des thérapies anti-cancéreuses. Ces protéines présentent une importante dynamique structurale et séquestrent les facteurs pro-apoptotiques au sein d’un réseau d’interaction complexe. Perturber ce réseau d’interaction libère les protéines apoptotiques dans les cellules tumorales et aboutit à l’induction de l’apoptose. Une approche thérapeutique utilisée en clinique repose sur l’antagonisme des protéines anti-apoptotiques avec des molécules chimiques appelées BH3 mimétiques. Ces molécules, qui ciblent le sillon hydrophobe des protéines anti-apoptotiques dans lequel se loge l’hélice alpha formée par les domaines BH3, ont été désignées à partir de données structurales réalisées avec des protéines recombinantes dans un environnement soluble. Dans un environnement cellulaire, nous avons montré que l’adressage membranaire de ces protéines limite l’efficacité d’antagonisme des molécules BH3m de certains complexes ciblés.

En combinant des analyses de ces interactions dans des cellules entières et vivantes par des approches de BRET, de simulations de dynamique moléculaire, et d’analyses d’énergie de liaison, nous montrons que les domaines trans-membranaires de BCL-xL et de son ligand pro-apoptotique PUMA exercent une régulation allostérique de la liaison du domaine BH3 dans le sillon de BCL-xL. Le site d’interaction entre ces protéines présente donc des différences avec celui défini par les études structurales in vitro. Nos résultats invitent donc à revisiter le design de molécules BH3m pour optimiser la sélectivité des complexes ciblés et leur efficacité thérapeutique. 

 Communication Flash 4

NanoBiT permet d’évaluer l'activité d’inhibiteurs ciblant Bdf1 dans des levures vivantes

Kaiyao Wei, Marie Arlotto, Justin M. Overhulse, Tuan-Anh Dinh, Yingsheng Zhou, Nathan J. Dupper, Jiayi Yang, Boris A. Kashemirov, Hasan Dawi, Cécile Garnaud, Gaëlle Bourgine, Flore Mietton, Morgane Champleboux, Amédé Larabi, Yordan Hayat, Rose-Laure Indorato, Marjolaine Noirclerc-Savoye, Dimitrios Skoufias, Muriel Cornet, Gwenaël Rabut, Charles E. McKenna, Carlo Petosa, Jérôme Govin

La protéine Bdf1 est une cible potentielle pour le traitement des infections fongiques invasives. Pour être efficace, son inhibition nécessite de bloquer simultanément l’interaction de ses deux bromodomaines (BDs) avec la chromatine. Nous avons identifié des composés ciblant avec des degrés de sélectivité variables les BDs de Bdf1 du pathogène Candida glabrata, par rapport à ceux de Brd4, son orthologue humain. Pour évaluer l'activité intracellulaire de ces composés, nous avons utilisé NanoBiT, un test de complémentation de fragments de luciférase, afin de quantifier l'interaction de Bdf1 avec la chromatine dans des levures vivantes. Nos résultats illustrent comment les tests NanoBiT dans des levures peuvent faciliter la découverte d'inhibiteurs d'interactions protéine-protéine.